Des enzymes à la fonction enzymatique

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Les hypothèses concernant le fonctionnement enzymatique seront présentées ici comme des données puisque le temps et le programme ne nous permet pas d'en faire l'étude expérimentale.

Le propos de départ ici est d'étudier des produits de l'expression de l'information génétique (à replacer dans la page générale). Il ne faut pas considérer ce chapitre comme un cours de biologie sur les enzymes, ce qu'il n'est pas.

Si l'on trouve encore parfois enzyme au masculin l'usage en fait un nom féminin: une enzyme.

Plan

1 - Les enzymes sont des biocatalyseurs:
2 - La réaction enzymatique se réalise à l'intérieur d'une poche appelée site actif
3 - La fonction enzymatique est une "fonction topologique"

la 3ème partie présente un éclairage plus original dans le cadre d'une biologie théorique d'inspiration Thomienne

1 - Les enzymes sont des biocatalyseurs: elles catalysent des réactions biochimiques (du vivant) qui appartiennent au métabolisme

Les enzymes sont des biocatalyseurs (catalyseurs de réactions biochimiques c'est-à-dire appartenant au métabolisme). Ce sont soit quelques rares acides nucléiques (RNA ou ribozymes) soit, pour la quasi totalité des enzymes, des protéines.

Elles ont une haute spécificité de substrat: elles agissent sur un substrat souvent spécifique mais rarement unique: deux substrats (spécifiques) sont souvent nécessaires car les réactions chimiques du vivant sont généralement couplées.

Un exemple mémorisable et réutilisable en terminale :

L'enzyme glucose 6 phosphatase catalyse deux réactions couplées:
- une phosphorylation du glucose (ajout d'un groupement phosphate sur le carbone n°6 du glucose)
- et une déphosphorylation de l'ATP (rupture de la très énergétique dernière liaison phosphate de l'ATP).

L'énergie fournie par la déphosphorylation (réaction exothermique) est supérieure à celle nécessaire pour la phosphorylation (réaction endothermique). Cette réaction est essentielle dans toutes les cellules qui consomment du glucose pour leur fermentation ou leur respiration car c'est par elle que commence toute utilisation énergétique de cette molécule (voir la glycolyse dans le cours de spécialité de Terminale S).

L'enzyme est l'hexokinase (1qha.pdb ; une fois la molécule un peu cernée, avec ses deux chaînes, je vous conseille le fichier kinemage qui permet de simuler le changement de conformation de la molécule lors de la liaison du glucose: fichier c6bFlex.kin (kinemage #7: ) disponible à l'adresse http://kinemage.biochem.duke.edu/kinemage/kinlist.php ; l'applet KING est à télécharger à la même adresse).

Elles sont une haute spécificité d'action: elles accélèrent des réactions chimiques spécifiques.

Elles agissent dans les conditions du vivant: en présence d'eau - et à fortiori in vitro en solution, même si ce n'est pas leur mode habituel d'action (voir page sur la cellule en travaux) - et dans des conditions de température et de pH très douces (optima situés bien sûr dans les conditions du vivant).

Pour comprendre la complexité et l'importance des enzymes ou plutôt de ce que l'on peut appeler les systèmes enzymatiques, il vous suffit de penser que le chapitre précédent nous donnait deux magnifiques exemples de complexes enzymatiques: les ADN polymérases, et les ARN polymérases, complexes et spécifiques, contrôlées et extrêmement actives dans la cellule.

L'enzyme est intégralement restituée en fin de réaction: elle n'est jamais consommée ni "usée" même si elle peut être inactivée.

Le site actif peut être décomposé en site de reconnaissance du substrat (qui peuvent être multiple) et site catalytique, lieu où est réalisée la réaction chimique catalysée (qui est très généralement unique).

L'enzyme se fixe au substrat, catalyse la réaction, puis se libère des produits.

Un schéma de pure illustration mais faux pour ce qui est de la compréhension fonctionnelle

Le site actif peut être séparé en site de reconnaissance, qui contrôle la spécificité de substrat et site catalytique, qui contrôle la spécificité d'action.

Ce sont les liaisons faibles (petits traits bleus) qui fournissent l'énergie nécessaire à la catalyse.

E = enzyme (restituée intégralement en fin de réaction);
S = substrat;
ES = complexe enzyme-substrat;
P1 et P2 = produits de la réaction.

Du point de vue énergétique, l'énergie fournie par l'enzyme lors de la catalyse est due à l'établissement de très nombreuses liaisons faibles au niveau du site actif entre l'enzyme et son substrat (énergie de liaison).

La cinétique enzymatique étudie IN VITRO l'évolution de la vitesse de la catalyse enzymatique en fonction des conditions expérimentales.

La vitesse V de la réaction enzymatique IN VITRO est proportionnelle à la concentration en substrat [S]. La vitesse maximale Vmax est atteinte lorsque l'enzyme est saturée (tous les sites actifs de toutes les enzymes présentes en solution sont susceptibles d'être occupés à une vitesse maximale).

Remarques:

* La réaction enzymatique peut être inhibée par la présence de molécules qui l'inactivent ou diminuent sont activité.

Un inhibiteur compétitif ne modifie pas la vitesse de la réaction enzymatique en présence de son substrat mais diminue l'affinité apparente de l'enzyme avec son substrat lorsqu'il est présent en solution. On interprète son action en proposant que l'inhibiteur compétitif entre en compétition avec l'enzyme en se fixant sur la partie de reconnaissance du site actif sans pouvoir être transformé. Selon son affinité il peut diminuer plus ou moins l'activité enzymatique. Une comparaison amusante que je tiens de mes années de classes préparatoires: l'enzyme est comparée à un mangeur de lentilles. Chaque cuillerée portée à la bouche puis avalée est une réaction enzymatique réalisée. Si l'on ajoute quelques PETITS cailloux dans le plat de lentilles, le mangeur porte à la bouche des cuillerées de lentilles avec une belle régularité mais doit recracher certaines cuillerées, comportant un petit caillou, ce qui diminue grandement la vitesse de réaction, mais pas la vitesse avec laquelle il porte les cuillerées à la bouche... Le petit caillou joue le rôle d'inhibiteur compétitif.

Un inhibiteur non compétitif ne modifie pas l'affinité apparente de l'enzyme avec son substrat mais uniquement la vitesse maximale de la réaction. On interprète cette action comme le résultat d'une fixation de l'inhibiteur non compétitif sur un autre site que le site catalytique de l'enzyme. Pour reprendre ma comparaison avec le mangeur de lentilles, l'inhibiteur compétitif peut être comparé à un GROS caillou dans les lentilles. Le mangeur les voit et les évite, ce qui diminue singulièrement sa vitesse de rotation des cuillerées.
L'interprétation que l'on fait de l'action des inhibiteurs va de pair avec celle des analogues de structure qui sont des substances voisines (au sens topologique) de molécules métaboliques ou informationnelles habituelles mais qui bloquent ou diminuent la fonction des molécules fonctionnelles ou informatives auxquelles elles se lient. La mise au point d'analogues de substrat est une des étapes essentielles de la recherche pharmaceutique.

 TP classique :
hydrolyse de l'ovalbumine par une pepsine

3 - La fonction enzymatique est une "fonction topologique"

Je rappelle que le mot fonction a tout intérêt à être défini au sens mathématique de la façon la plus rigoureuse qui soit. Une fonction biologique c'est un phénomène qui peut être représenté par une fonction mathématique (voir cours de seconde et une petite page sur les mathématiques en SVT en seconde). Ici nous nous intéressons à des fonction locales et donc que l'on peut explorer expérimentalement.

La topologie est une branche des mathématiques qui s'intéresse aux propriétés de l'espace et des ensembles de définition des fonctions du seul point de vue qualitatif; elle précise les notions de continuité-discontinuité, bords, limites...

Mais comment comprendre l'activité enzymatique ? Une fois encore on a (au moins) deux attitudes (voir aussi la page de synthèse sur les niveaux d'organisation du vivant) :

- chercher à comprendre comment est "contrôlée" la forme de l'enzyme (et plus particulièrement du site actif) et en quoi cette forme permet l'activité catalytique au niveau chimique (liaisons faibles, transfert de charges...). C'est la voie du réductionnisme. Je vous propose une autre voie.

- accepter comme un fait expérimental (empirique) ce contrôle de la forme et chercher à en formaliser les limites. C'est la voie du structuralisme. Toute fonction topologique - qui repose sur une correspondance des formes - pourrait être appelée enzymatique. René Thom en a dessiné les contours (dans Modèles mathématiques de la morphogénèse (1971, 1974, 1980) notamment).

Voici quelques exemples de ces deux attitudes:

La correspondance entre les formes du site actif de l'enzyme et de la forme de transition du substrat conduit à l'établissement de très nombreuses liaisons faibles (Van der Wals, hydrophobe...) qui sont responsables de l'apport d'une énergie qui expliquerait l'activité enzymatique elle-même. Cette manière de voir, encore bien mystérieuse, est plus qualitative que quantitative. Pour essayer de réduire l'activité enzymatique à des phénomènes moléculaires connus on peut considérer qu'elle repose sur la capacité de molécules à établir des liaisons ou à les rompre, ce qui est la base de toutes les réactions chimiques. Cette capacité dépend bien sûr des propriétés propres de la molécule (répartition de ses charges dues à son composants et à ses groupes caractéristiques (que l'on appelait auparavant improprement "fonctions"), ... ) mais aussi des conditions physiques du milieu (pression, température, ligands, charges voisines dont surtout molécules d'eau...).

L'activité enzymatique dépend donc d'une part de conditions propres de la molécules (internes ou intrinsèques) et de conditions du milieu (externes ou extrinsèques). Il y a un réductionnisme interne et externe (voir René Thom, Modèles mathématiques de la morphogénèse, p 42 et s).
Pour une protéine enzymatique on relie habituellement les conditions propres à plusieurs niveaux d'organisation:
- la structure primaire qui est la séquence des aa de chaque chaîne de la protéine (qui peut en comporter plusieurs): elle est due aux liaisons COVALENTES : liaisons peptidiques (-CO-NH-) entre les groupes fonctionnels carboxyle (-COOH) et amine (- NH₂) des aa et liaisons disulfure (-S-S- ) entre les radicaux (-SH) des aa cystéine (Cys).
- les structures d'ordre supérieur (2 à 4) qui correspond au repliement de chaque chaîne et à leur association entre elles (et avec des groupements supplémentaires dits prosthétiques pour les hétéroprotéines) par des liaisons FAIBLES.
La structure primaire est en relation indirecte (par l'intermédiaire du code génétique, des ribosomes, des ARNt) avec l'information génétique des ARNm recopiée à partir de celle de l'ADN. On sait modifier - par génie génétique - l'information génétique ou des étapes de la synthèse des protéines au sens large (de la transcription, de la maturation des ARNm ou de la traduction) afin de faire produire à une cellule des enzymes à activité réduite ou supprimée.

MAIS,
plus on avance dans la connaissance des protéines moins il devient évident de relier la structure primaire avec la forme de molécule; au contraire, les formes des protéines sont caractérisées par un nombre limité de formes de base
(ou motifs - voir par exemple Les protéines, rouages des cellules, H. Berman, D. Goodsell et P. Bourne, Pour la Science, Dossier n°46, janvier mars 2005, p 32;
plus récemment voir Sebastian E. Ahnert, Joseph A. Marsh, Helena Hernandez, Carol V. Robinson, Sarah A. Teichmann
Principles of assembly reveal a periodic table of protein complexes
Science 350, 1331 and aaa2245 (2015). DOI: 10.1126/science.aaa2245 :
http://www.periodicproteincomplexes.org )
 qui sont obtenus pour des séquences très différentes étant donné les profondes similitudes des aa vis-à-vis du composant majoritaire de la cellule: l'eau (voir remarque ci-dessous et la page code génétique). Avec la démarche inverse il est clair que la prédiction (complète) de la structure d'ordre supérieur à partir de la structure primaire est impossible. Par contre, si l'on s'appuie sur une théorie du type de celle de la théorie des catastrophes, il devient possible de prévoir la forme d'une molécule à partir de sa fonction (et non plus de sa séquence primaire), comme on peut le faire pour une protéine enzymatique (voir paragraphe ci-dessous: voie structurale).
Il est aussi important de ne pas confondre la stabilité de la forme (ou conformation stable au sens de forme dans l'espace) d'une protéine isolée (ce que l'on peut relier à sa capacité à cristalliser - c'est-à-dire former un cristal ordonné -, et qui dépend bien sûr de sa structure aux différents niveaux) et l'ordre (voir Le désordre, clé de voûte des protéines, Véronique Receveur-Béchot et David Karlin, La Recherche, juin 2005, 387, 52-55). De nombreuses protéines (probablement plus de la moitié des protéines connues) présentent pour la totalité, ou pour une partie de leur séquence, des zones qui ne se replient pas (appelées maladroitement "désordonnées" ou pire "non structurées" ) et qui n'en sont pas pour autant moins essentielles dans la fonction de la protéine. Les fonctions associées sont encore insuffisamment vulgarisées mais il est probable que l'on découvre une grande diversité de fonctions mécaniques (l'article de La Recherche cite notamment la titine, protéine géante, assurant la cohésion des myofibrilles...) ou chimiques. Ces protéines n'auraient pas une activité de type enzymatique au sens défini ci-dessus de "fonction topologique" mais bien des fonctions mécaniques, électriques ou chimiques variées: ce ne seraient pas des enzymes mais des protéines fonctionnelles (ayant une fonction propre liée à leur structure mais pas à une structure trimensionnelle ou conformation spatiale STABLE).
Les conditions externes de l'activité enzymatique sont très mal connues IN VIVO.

Remarque:
L'élément essentiel dans une cellule vivante est l'eau (une cellule comprend 80% d'eau environ). Mais cette eau n'est pas libre et n'est donc pas disponible comme solvant. Les modèles d'activité enzymatique calculés à partir d'expériences in vitro, en solution aqueuse sont inappropriés pour le vivant (et plus encore les logiciels de simulation - strictement "abio"chimiques - qui ne représentent jamais les complexes enzymatiques pourtant omniprésents dans les cellules).
On sait qu'une couche d'eau extrêmement fine (d'une épaisseur de quelques molécules soit 1,1 nm environ - voir page sur la cellule) entoure toutes les macromolécules cytoplasmiques. On l'appelle "eau interfaciale". Cette eau peut favoriser ou au contraire défavoriser la liaison enzyme-substrat. On peut aller jusqu'à dire (en restant dans une approche réductionniste) que c'est cette eau interfaciale qui contrôle l'activité enzymatique.

Si la fonction enzymatique est topologique (au niveau moléculaire) on va donc pouvoir trouver - pour une enzyme donnée - une autre molécule, qui ne soit pas forcément une protéine (et qui habituellement n'a pas d'activité chimique réactionnelle) mais qui va pouvoir présenter une fonction catalytique due uniquement à sa forme.

On a d'abord découvert des ARN à fonction enzymatique (les ribozymes) qui peuvent catalyser la coupure d'autres ARN (ARNase P) ou même ce que l'on appelle improprement une autocatalyse (les molécules d'ARN "autocatalytiques" de certains virus ou fabriquées artificiellement sur ce modèle étant susceptibles de se couper elles-mêmes en plusieurs fragments) - un catalyseur par définition doit être restitué intégralement en fin de réaction ce qui n'est pas le cas dans une "autocatalyse". Mais la connaissance topologique de ces "enzymes" reste insuffisante.

C'est Linus Pauling en 1940 qui émit une hypothèse beaucoup plus générale et qui va tout à fait dans le sens structural: il suggéra de rechercher des anticorps (notés Ac; ce sont des glycoprotéines formées de 4 chaînes associées en forme d'"y" - voir immunologie en classe de terminale) dirigés contre l'état de transition d'un substrat réactionnel, qui devraient donc être doués d'une activité catalytique. On a leur a donné le nom d'abzymes. Vous remarquerez aisément que l'on n'a aucun moyen d'isoler le site actif d'une enzyme. On est donc bien obligé de passer par des l'état de transition. Mais comme ce dernier est beaucoup trop instable pour être observé il faut bien passer par des analogues de l'état de transition. On les repère en cherchant des molécules qui se fixent au site actif d'une enzyme avec des affinités encore beaucoup plus importantes que le substrat réactionnel et qui y restent...(ce sont des inhibiteurs de type bloquants : ils réalisent une inhibition irréversible). Cependant, à partir de 1974, lorsque la notion de réseau idiotypique a été formalisée par Niels Kaj, on a élargi la recherche des analogues à celle des Ac dirigés contre des épitopes des Ac dirigés contre une enzyme et ainsi produire des Ac dirigés spécifiquement contre le site actif de l'enzyme. Il a fallu attendre 1986 pour obtenir les premières abzymes. Les molécules d'Ac ont naturellement une diversité topologique quasi infinie. On produit notamment des abzymes en sélectionnant (de façon indirecte par des molécules qui fixent elles aussi ces mêmes Ac) des Ac dirigés vers le site actif d'enzymes (sorte de moule interne du site actif). Puis on fabrique des Ac complémentaires de ces Ac (moule externe de ces moules internes) et qui possèdent alors une activité catalytique voisine de l'enzyme.

On peut élargir le concept d'enzyme à toute structure qui, par correspondance topologique avec un état transitionnel, permettrait une activité. C'est ce que Thom appelle l'effet enzymatique, si je ne me trompe.

Deux extraits de Stabilité structurelle et morphogénèse - Essai d'une théorie générale des modèles, 1968 (stabilite.pdf)

« Dans un autre exemple tiré des solides, le système clef-serrure cher aux biochimistes, il ne peut y avoir interaction qu'à condition de supposer la clef mobile (dans toutes les positions permises dans le complémentaire de la serrure) ; une clef n'est porteuse de signification pour une serrure que si l'on l'enfile et on la tourne. On a là un exemple typique d'une situation où, si l'on prend clef et serrure statiquement, presque toute la structure de leur interaction repose sur l'agent moteur, l'individu qui tourne la clef, autrement dit sur le potentiel d'interaction ; si l'on veut se placer dans une optique qui élimine l'interaction, il faut rendre les deux systèmes mobiles ». (p 187)

« B. Morphologie et Biochimie
On peut d'ailleurs se demander d'ores et déjà si, au lieu d'expliquer la Morphogénèse par la Biochimie, ce n'est pas l'attitude inverse qu'il convient de prendre. Le problème de déterminer la structure tertiaire d'une protéine en fonction de sa structure primaire est, typiquement, un problème de dynamique des formes (au sens du chapitre 7) ; il s'agit de déterminer les minima de la fonction U, énergie libre, sur l'espace fonctionnel L de toutes les configurations de la molécule ; qui pourrait douter que l'ensemble S de bifurcation de L, qui représente l'ensemble des positions où la molécule se recoupe, ne joue un rôle de singularité pour U? Et que la topologie relative des bassins des différents minima de U ne joue un rôle essentiel dans l'activité, enzymatique ou motrice, de la molécule ? L'étude récente de diverses enzymes (le lysozyme, par exemple) a montré l'aspect éminemment morphologique de bien des réactions enzymatiques ; on voit les molécules se palper, se pincer, se tordre, se déchirer presque comme des êtres vivants ; il ne faut pas s'en étonner ; dans la mesure où une réaction biochimique reflète un incident local d'une compétition spatiale entre différents régimes, les contraintes topologiques imposeront à ces incidents locaux de simuler les catastrophes globales de la morphogenèse sur l'espace-temps R⁴. En bien des cas, ces mécanismes moléculaires se sont imposés parce qu'ils réalisaient la meilleure simulation locale de la catastrophe biologique globale qui leur a donné naissance. Le fait que certains de ces mécanismes persistent in vitro ne doit pas dissimuler leur origine et leur signification biologiques. Ces réactions présentent alors une grande stabilité interne vis-à-vis du milieu ambiant ; elles perdent d'ailleurs in vitro l'aspect polarisé et orienté qu'elles présentent en milieu vivant. Il est frappant d'observer à cet égard, que les réactions de réplication génétique affectant l'ADN - dont on a voulu faire l'essence même de la vie - sont relativement grossières et résistantes, alors que les réactions qui dominent toute l'énergétique vitale, comme celles qui ont lieu dans les plastides et les mitochondries, dépendent d'une morphologie qu'on n'a pu jusqu'à présent reproduire in vitro.» (p 216)

Il n'est pas faux de dire que la tentative pour comprendre les enzymes "à la manière de Thom" s'apparente à une redécouverte de la notion d'enzyme-propriété qui s'est longtemps opposée à celle d'enzyme-substance (cf EU article "enzymes"); l'histoire est un éternel recommencement. Le projet est bien d'unir en dépassant l'apparente séparation entre ces deux notions.
Si l'on reste au niveau local on ne voit que des discontinuités (liaisons établies ou rompues) alors qu'au niveau global, analogique du niveau du vivant, on voit des enzymes reproductrices (qui réalisent des isomorphismes... comme une ADNpolymérase (ou plutôt tout le complexe réplicatif dont l'ADNpol) qui fabrique une copie d'une molécule... ), des enzymes relationnelles (protectrices (chaperonines... par isolement de la structure à protéger), informatrices (par déformation d'une cible et non pas reproduction d'une déformation...)....) et des enzymes nourricières (qui transfèrent de la matière ou de l'énergie...)...

pour les données moléculaires simples de niveau lycée voir la page :
le gène moléculaire, unité fonctionnelle synthétique

Les éléments qui suivent sont repris de la conférence du 4^e congrès BCM - Poitiers 2005 (voir la 2ème partie)- la réflexion y est plus complète

On est tenté d'assimiler le plan (x,y) des observations au plan (x,t) des positions, mais cela n'est pas possible car on a un cadavre fixé et coloré. Les physiciens utilisent l'espace des phases* (voir page sur le continu). Pour un point animé d'un mouvement dans un plan , l'espace des phases est un plan (x,v). On pourrait alors avoir une spirale divergente (ou convergente) dans le cas d'un système linéaire amorti. Dans l'espace des positions on a une trajectoire linéaire bornée aux deux extrémités, ce qui n'a rien à voir avec notre "spirale". Pour obtenir une telle morphologie la dynamique est donc plus compliquée (deux attracteurs** au moins doivent s'affronter). Il faut approfondir ses bases mathématiques et surtout géométriques et analytiques.

*espace abstrait qui permet de définir complètement l'état d'un système à partir de la connaissance des coordonnées de ce système dans cet espace

** attracteur; régime asymptotique stable (atteint au bout d'un temps infini)

La fronce permet une représentation d'une dynamique analogue à la dynamique polysomiale dans un espace des phases dont les paramètres sont à préciser

On notera que la dynamique proposée est récurrente pour les modèles thomiens (peut-être parce qu'elle représente un premier niveau d'approche - qu'il est bien sûr nécessaire de la préciser, ce qui ne peut être fait à ce niveau de compréhension - mon propos ici n'est que de souligner l'analogie en me servant d'un outil... que je ne maîtrise pas mais dont je vois l'utilisation que pourrait en faire un mathématicien). L'arbre à came de droite est analogue à la forme des polysomes dans l'espace cytoplasmique fixé et mort.

On peut penser que dans ce cas la dynamique proposée est pertinente et qu'il ne reste qu'à trouver les paramètres qui ont été figés dans la coupe. Si le système de synthèse protéique est stable il n'est pas étonnant que la surface fronce représente une coupe de l'espace euclidien. Il est urgent de s'efforcer de trouver des paramètres pertinents de la dynamique métabolique cytoplasmique. C'est un travail que je ne peux faire seul. J'en appelle une fois encore à l'inventivité de notre jeune génération.
On remarquera que l'initiation est habituellement représentée au centre de la figure mais je ne connais aucun argument en faveur de cette hypothèse. La dynamique présentée ici exige que l'initiation se fasse sur le bord externe du polysome (l'extrémité 5' de l'ARNm avec sa coiffe ("cap structure") doit se trouver à cet endroit et non au centre). Je souligne deux points. D'une part, une dynamique convergente (même si ce n'est pas dans l'espace euclidien) est plus parlante et conforme à l'intuition (la libération des sous-unités ribosomiales au point de potentiel le plus bas permet aisément une récupération au niveau du site d'initiation voisin). D'autre part, on peut penser qu'il existe une fonction de structuration de la protéine au sein du polysome, les ribosomes pouvant intervenir comme "chaperons". Ceci est une piste de recherche ouverte (interactions sous-unités ribosomiales - polypetide en formation). En tout cas la localisation du point d'initiation devrait pouvoir être assez facilement précisée expérimentalement.