Des bactéries transgéniques productrices d'insuline
(corrigé)
Les manipulations nécessaires à la
transgénèse réussie réalisée ici
peuvent réparties en 3 étapes successives:
1. L'obtention du gène de l'insuline humaine
Cette étape n'est pas documentée ici mais pour ce
que nous savons de l'insuline, sécrétée par les
cellules ß des îlots de Langerhans du pancréas,
après le cours de 1ère S sur la glycémie, cela
n'a pas du être facile. En effet, l'insuline est une
protéine de 51 aa qui comporte deux chaînes (21
et 30 aa respectivement) réunies par des ponts disulfure. Le
peptide, car ce n'est pas une protéine au sens strict
(c'est un polypeptide de moins de 100 aa et de moins
de 10.000 daltons puisque son poids moléculaire est de 5733
daltons, du moins pour l'insuline bovine car je n'ai pas le chiffre
pour l'insuline humaine, mais il n'y a que quelques aa de
différents), est synthétisé sous forme
d'un long peptide de 86 aa, la proinsuline, qui est
scindée dans l'appareil de Golgi en insuline et en peptide C
de 35 aa. Le gène de l'insuline humaine est morcelé en
unités codantes et non codantes et le premier ARNm messager
transcrit subit une maturation complexe.
Nous reviendrons sur les caractéristiques de ce gène
dans la dernière partie.
2. L'insertion du gène "humain" dans un vecteur
d'insertion et sa multiplication: le plasmide pBR322 d'Escherichia
coli.
Le plasmide bactérien pBR322 est isolé d'Escherichia
coli (document 1). Il possède deux caractéristiques
essentielles qui en font un vecteur idéal:
- il possède un seul site de restriction pour une
enzyme (pstI) qui est situé au milieu d'un gène
de résistance à un antibiotique (l'ampicilline).
On peut donc utiliser cette enzyme de restriction (pstI) pour
insérer le gène de l'insuline humaine qui aura
été isolé du génome humain à
l'aide de la même enzyme de restriction. L'utilisation de la
même enzyme de restriction permettant d'assurer la
présence d'extrémités cohésives
qui permettent, dans le meilleur des cas la formation de plasmides
recombinés (ou chimères), ayant
intégré le gène de l'insuline humaine au
milieu de leur gène de résistance à
l'ampicilline. La position du site de restriction au sein d'un
gène de résistance à un antibiotique permet
de réaliser facilement le criblage des
transformants, c'est-à-dire le tri des plasmides ayant
intégré le gène humain (plasmides
recombinés ou chimères ou transformants). En fait ce
criblage ne se fait pas sur les plasmides mais sur les souches
d'Escherichia coli ayant intégré un plasmide.
Il y a donc une étape supplémentaire d'insertion du
vecteur (transformé ou non) dans des cellules vivantes
bactériennes qui constituent l'organisme multiplicateur
(phase de multiplication). Le plasmide pBR322 constitue un
vecteur d'insertion (du gène dans un organisme
vivant) et Escherichia coli, avec son plasmide
transformé, constitue le vecteur de multiplication.
On réalise UNE RÉPLIQUE (technique des empreintes
sur velours, document 2) sur un milieu contenant l'antibiotique
(ampicilline) et les souches qui ne se développent pas sont
les souches qui n'ont PAS intégré le gène
"humain". On peut donc les repérer sur le milieu de culture
original et les cultiver séparément. On a donc une
souche d'Escherichia coli qui a intégré, dans
son cytoplasme, un plasmide pBR322* recombiné (porteur du
gène de l'insuline humaine).
- il possède un autre gène de résistance
à un autre antibiotique (la tétracycline, document
1). L'intérêt de la présence d'un autre
gène de résistance permet de travailler sur des
milieux de culture enrichis avec cet antibiotique et donc de ne
permettre le développement que de souches
résistantes. On empêche ainsi le développement
de souches "parasites" extérieures qui contamineraient le
milieu de culture. (Document 2)
3. L'expression du gène inséré
Cette étape n'est qu'évoquée à la fin
du document 2. Du fait de sa complexité et de son
caractère partiellement secret, au moins du point de vue des
techniques d'obtention, cette étape n'est pas à
proprement parler scientifique (la science nécessite la
communication à la communauté scientifique des
résultats en vue d'une reproduction). Un gène comprend
des séquences de régulation qu'il a fallu trouver et
insérer en amont du gène humain. Des séquences
plasmidiques et bactériennes on été
utilisées. La souche bactérienne
génétiquement modifiée (OGM) a été
brevetée et est exploitée. Elle libère
directement l'insuline dans le milieu de culture d'après mes
souvenirs.
La réussite (aussi médicale, ou tout au moins
pharmaceutique) qui a couronné des années de recherche
(coûteuses) a permis, dans ce cas particulier, un retour sur
investissement annonciateur d'autres succès, au dire de ses
partisans.
La présentation simplifiée que nous avons faite ici du
génie génétique ne montre pas forcément
tous les aléas de cette technique coûteuse.
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